【摘要】目的：构建大鼠白细胞介素12(rIL-12)基因真核表达载体质粒，建立rIL-12基因修饰并稳定表达的大鼠胶质瘤9L/rIL-12细胞。方法：用Trizol提取大鼠腹腔巨噬细胞总RNA，RT-PCR方法分别获取rp40和rp35cDNA，依次克隆入pcDNA3.1(-)/myc-HisA质粒中，以IRES连接双亚基，构建成双顺反子真核表达载体质粒pcDNA3.1/rIL-12。将构建的重组质粒转染大鼠胶质瘤9L细胞，G418筛选单克隆细胞株，ELISA法检测其培养上清rIL-12(p70)蛋白含量，同时抽提细胞RNA，RT-PCR方法检测rp40、rp35基因在9L/rIL-12细胞中的表达。结果：所得rp40cDNA序列与GeneBankNM022611及AF133197、rp35cDNA序列与GeneBankNM053390及AF177031均一致，构建的质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确。质粒转染9L细胞后，获得2个rIL-12基因稳定、高效表达的9L/rIL-12单克隆细胞株，其培养上清rIL-12(p70)蛋白含量分别为139.0、162.1pg/ml，RT-PCR结果显示细胞中rIL-12基因表达呈阳性。结论：成功构建了rIL-12真核表达质粒pcDNA3.1/rIL-12，并建立了9L/rIL-12细胞株，为rIL-12基因修饰的胶质瘤疫苗研究打下了基础。

【关键词】大鼠 白细胞介素12质粒 神经胶质瘤 9L细胞

免疫疗法被视为有前景的胶质瘤治疗新模式。利用免疫细胞因子及基因治疗可以增强机体抗肿瘤的免疫反应，其中白细胞介素12(IL-12)以其广泛的生物学效应、强大的抗肿瘤作用，被誉为最有效的抗肿瘤细胞因子之一^①②。

本研究利用脂多糖(LPS)刺激体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞，提取细胞RNA，RT-PCR扩增出大鼠IL-12(rIL-12)的rp40及rp35cDNA，将之依次亚克隆至pcDNA3.1(-)/myc-HisA质粒中，并用脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入位点(internalribosomeentrysite，IRES)进行连接，构建成rp40及rp35两亚基的双顺反子真核表达质粒pcDNA3.1/rIL-12，应用该质粒转染大鼠胶质瘤9L细胞，建立rIL-12基因稳定表达的9L/rIL-12细胞株。

1、材料与方法

1.1 细菌、质粒与细胞大肠杆菌感受态细胞DH-5α为Tiangen产品。pcDNA3.1(-)/myc-HisA/IRES质粒由英国格拉斯哥大学免疫和细菌学室XiaoqingWei博士惠赠。野生型大鼠胶质瘤9L细胞株由美国洛杉矶加州大学神经外科LindaMLiau博士惠赠。

1.2 实验 动物雄性Wistar大鼠购于南方医科大学实验动物中心(粤检证字2002A041)，5~6周龄，体质量(250±50)g，由广州军区广州总医院医学实验动物中心按清洁级动物饲养。

1.3 主要试剂 LPS为Sigma产品，Trizol、G418、LipofectamineTM2000为Invitrogen产品，各种限制性内切酶、高保真PyrobestTaq酶、T4DNA连接酶为TaKaRa产品，反转录试剂盒为Promega产品，凝胶回收试剂盒为U-gene产品，质粒提取试剂盒为Tiangen产品，大鼠IL-12(p70)ELISA试剂盒为Biosource产品，DMEM、胎牛血清(FBS)均为Gibco产品。

1.4 引物设计与合成 参照GeneBank中rIL-12的cDNA序列，利用VectorNTIAdvance10软件设计rp40和rp35的PCR引物，rp40上游引物5端加上XhoⅠ(CTCGAG)酶切位点，下游引物5端加上NotⅠ(GCGGCCGC)酶切位点，rp35上游及下游引物5端均加上EcoRⅠ(GAATTC)酶切位点。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因为RT-PCR内参，长度为252bp(表1)。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.5 大鼠腹腔巨噬细胞的制备及IL-12基因的克隆 参照文献^③提取Wistar大鼠腹腔巨噬细胞，加入10μg/mlLPS培养12～24h，收集细胞，Trizol提取细胞总RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板，分别用rp40、rp35引物PCR扩增rp40、rp35基因片段;反应条件：预变性94℃5min，94℃45s、63℃45s、72℃45s循环30次，延伸72℃5min，4℃保持。1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，紫外灯下切割目标基因条带，凝胶回收基因片段。分别以XhoⅠ、NotⅠ双酶切rp40基因片段，EcoRⅠ单酶切rp35基因片段，酶切产物电泳分离，再次凝胶回收、纯化，获得可以用于亚克隆的两基因片段。

1.6 重组质粒pcDNA3.1/rIL-12的构建及鉴定 具体方法参照文献^④，分两步构建：首先以XhoⅠ、NotⅠ双酶切载体质粒pcDNA3.1(-)/myc-HisA-IRES，回收线性化的载体片段并与rp40基因片段连接，构建中间质粒pcDNA3.1/rp40-IRES。然后以EcoRⅠ单酶切质粒pcDNA3.1/rp40-IRES，回收线性化的载体片段，再与rp35基因片段连接构建pcDNA3.1/rp40-IRES-rp35(即重组质粒pcDNA3.1/rIL-12)。以重组质粒为模板，PCR鉴定rp40、rp35基因的表达。分别用EcoRⅠ单酶切、XbaⅠ单酶切、XbaⅠ和NotⅠ双酶切重组质粒，并利用VectorNTIAdvance10软件预测酶切结果。质粒DNA测序由大连宝生物工程有限公司完成，以测序结果鉴定rp35基因插入方向正确与否。构建的重组质粒经鉴定正确后，大提质粒备用。

1.7 质粒pcDNA3.1/rIL-12转染9L细胞9L细胞的培养参照文献^⑤。重组质粒采用脂质体介导方法和电穿孔方法转染野生型9L细胞。脂质体介导转染方法按LipofectamineTM2000说明书进行。电穿孔方法按GenepulserXcellTMelectroperationSystem(BioRad产品)操作指南进行，参数为方波、300V、20ms。

1.89 L/rIL-12单克隆细胞株的建立及rIL-12的表达 质粒转染9L细胞后，G418(终浓度600μg/ml)筛选7～14d，采用有限稀释法和画圈法挑取单克隆细胞株培养、扩增、传代。将筛选的单克隆细胞株各代细胞分别取5×106细胞数，用10ml含G418的DMEM完全培养液定量培养72h，取上清，按Biosource试剂盒说明书，采用ELISA方法检测rIL-12(p70)浓度;同时用Trizol抽提细胞的总RNA，RT-PCR检测细胞中rp40、rp35基因的表达。

2、结果

2.1 rIL-12基因克隆及重组质粒构建 经LPS刺激的大鼠腹腔巨噬细胞提取的RNA经RT-PCR扩增出rp40及rp35cDNA片段，大小分别约为1008bp和647bp，酶切纯化后依次亚克隆入载体质粒pcDNA3.1(-)/myc-HisA-IRES相应的位点，构建成rp40和rp35两亚基双顺反子真核表达的重组质粒pcDNA3.1/rIL-12。

2.2 重组质粒鉴定 以重组质粒为模板行PCR扩增，产物电泳显示rp40和rp35条带清晰。质粒酶切鉴定，电泳条带与预测吻合，其中EcoRⅠ单酶切可将插入的rp35基因切下;rp40基因中存在1个XbaⅠ酶切位点，XbaⅠ单酶切质粒出现3条带;XbaⅠ和NotⅠ双酶切因缓冲体系不同仅出现2条带。重组质粒测序结果与GeneBank比对，rp40cDNA序列与NM022611及AF133197、rp35cDNA序列与NM053390及AF177031均一致，rp35基因插入载体质粒方向正确。

2.3 9L/rIL-12细胞的建立及rIL-12基因表达 重组质粒转染野生型大鼠9L细胞后，共获得12个9L/rIL-12单克隆细胞株，其中第2、7号单克隆细胞株传至第5代，以5.0×106细胞数/10ml定量培养72h，ELISA检测培养上清中rIL-12(p70)蛋白浓度分别为139.0、162.1pg/ml。Trizol抽提2、7号克隆株第5代细胞总RNA，RT-PCR结果显示rp35和rp40基因表达均为阳性。

3、讨论

IL-12最早称为自然杀伤细胞刺激因子(NKCSF)^⑥或细胞毒淋巴细胞成熟因子(CLMF)^⑦。IL-12具有广泛的生物学活性，主要有以下功能：①促进T细胞及NK细胞增殖，并通过促进分泌IFNγ而增强其杀伤活性;②促进Th1型细胞免疫反应;③促进多种黏附分子和MHC分子的表达，从而增强肿瘤细胞的免疫原性;④抑制瘤体内新生血管形成，从而抑制肿瘤生长;⑤促进一氧化氮生成，导致肿瘤细胞凋亡;⑥特别具有对抗TGF-β、PGE-2、IL-10、IGF-Ⅰ等胶质瘤分泌的免疫抑制细胞因子作用，从而有助于改善肿瘤局部免疫抑制状态的微环境。IL-12是最有效的抗肿瘤细胞因子之一，是连接体内天然免疫与特异性免疫的桥梁^①②。

IL-12主要由抗原提呈细胞，如巨噬细胞、树突状细胞、B淋巴细胞等以“旁分泌”的形式在局部发挥作用。全身给药时，不仅肿瘤局部IL-12浓度难以达到抗肿瘤的要求，而且大剂量的反复应用可引起严重副反应，在脑瘤治疗中可引起严重脑水肿。将IL-12基因转导细胞后再用于体内，通过细胞表达，IL-12以旁分泌的形式在局部发挥作用，副反应小，更符合其在体内作用的生理模式^⑧。

IL-12是由二硫键连接两亚基的异二聚体，两亚基相对分子质量为35ku和40ku，由位于不同染色体上的基因p35和p40编码，其中p35亚基决定IL-12的种属特性，而p40亚基包含与IL-12受体结合的必需基团，且其前端包含促进IL-12分泌至细胞外的信号肽。p40单体或同二聚体可与IL-12竞争结合受体而强烈拮抗IL-12的生物学活性，在转染哺乳动物细胞时，只有两亚基在体内等量表达并正确折叠，才能形成有生物学活性的IL-12^⑥⑦。因此，采用其进行基因治疗前，必须构建两亚基等量共表达的载体^⑨。目前国内外学者多采用IRES连接p40和p35的方法构建双亚基共表达的载体，通过IRES在翻译过程中的内启动作用实现同一转录水平上的等量表达。

国内已经有成功克隆小鼠IL-12基因的报道^⑩，但大鼠IL-12基因克隆尚未见文献报告。本研究通过提取大鼠腹腔巨噬细胞总RNA，RT-PCR扩增出rIL-12的rp40及rp35cDNA，将其依次克隆至pcDNA3.1(-)/myc-HisA质粒中，并用IRES连接，构建成同时含rIL-12rp40及rp35两亚基的双顺反子真核表达质粒pcDNA3.1/rIL-12。将构建的质粒转染大鼠胶质瘤细胞9L，获得rIL-12基因稳定表达的9L/rIL-12单克隆细胞株，其培养上清经ELISA检测，rIL-12(p70)蛋白分泌量达139.0、162.1pg/ml。大鼠IL-12双顺反子真核表达质粒pcDNA3.1/rIL-12的成功构建及9L/rIL-12细胞株的建立，为IL-12基因修饰的大鼠胶质瘤疫苗研究打下了基础。

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